Bosch SHV 4800 User Manual

Diagnostische DNA-Microarrays zum Nachweis von β-Lactam-Resistenzen in der klinischen Mikrobiologie mittels Genotypisierung bakterieller Resist

Summary 6 effect between the antibiotics tested and β-lactamase inhibitors, coexistence of the ESBL with other beta-lactamases, e. g. IRTs or plasmid

Ergebnisse 96 GEg essentiell, da auch hier der Sequenzunterschied nur ein einzelnes Nukleotid betrifft. Die Unterscheidung zwischen SEg R2 und GEg R

Ergebnisse 97 1 32 1 3 2 1 3 2 1 3 2 (a) (b) (c) (d) 1 2 1 2 3 2 4 4 1 Abbildung 3-27: Redesign des Sondensatzes SHV 238/240. Ergebnisse der Tes

Ergebnisse 98 Tabelle 3-7: Verschiedene Varianten des Sondensatzes SHV 238/240 Bezeichnung Sondennamea Sondensequenzb LängecTMdHaarnadel ΔGe Dim

Ergebnisse 99 Für die abschließende Betrachtung des überarbeiteten Sondensatzes zeigt Abbildung 3-28 die Auswertung der in Abbildung 3-27 gezeigten

Ergebnisse 100 Empfindlichkeitstestung (z. B. Agardiffusionstests) gemäß CLSI-Richtlinien und der halbautomatischen Bestimmung (VITEK 2XL System) der

Ergebnisse 101 et al. 2005). Die Einbauraten wurden mit Formel (2) berechnet. Die Einbauraten der TEM/SHV-PCR-Produkte variierten zwischen 45 und 17

Ergebnisse 102 (b) (a) Abbildung 3-31: Multiplex-PCR mit unterschiedlichen Primern für die verschiedenen blaCTX-M-Gruppen (siehe Ta

Ergebnisse 103 3.1.5.2. Layout und Abdeckung Für die Validierung mit klinischen Isolaten wurde das Layout des umgestalteten Dreifach-Chips (siehe

Ergebnisse 104 Abbildung 3-33: Layout des Chips zur Genotypisierung von TEM-, SHV- und CTX-M-β-Lac

Ergebnisse 105 Abbildung 3-34: Hierarchische Auswertung der Fluoreszenzsignale. (a) Fluoreszenzbild nach

Summary 7 Integrated Detection of TEM, SHV and CTX-M beta-lactamases The development of the described chip included the integration of chip prototy

Ergebnisse 106 Abbildung 3-34 zeigt beispielhaft das Hybridisierungs-Ergebnis (Abbildung 3-34 a) und die hierarchische Auswertung für Isolat 18. Abbi

Ergebnisse 107 Tabelle 3-8: Genotypisierung der klinischen Isolate Microarray-Ergebnisseb MHK Nr.a Isolat blaTEM blaSHV blaCTX-M CTX CAZ CTX

Ergebnisse 108 3.1.5.4. Genotyp-Phänotyp-Korrelation Die mit Hilfe des Microarrays ermittelten Genotypen konnten die Phänotypen von 56 der 60 getest

Ergebnisse 109 3.1.5.5. Leistungsfähigkeit der Sondensätze Wie bereits in den vorangegangenen Abschnitten, wurde die Leistungsfähigkeit eines einz

Ergebnisse 110 Der Sondensatz TEM 184R zeigte wie erwartet eine deutlich verbesserte Diskriminierung. Der SHV-Sondensatz 226 konnte die entsprechende

Ergebnisse 111 TEM 237.2R aufgrund eines günstigeren Signalmusters vorgezogen. Für diesen Sondensatz stehen daher nur noch wenige weitere Sondendesi

Ergebnisse 112 Anwendung eines deutlich konservativeren Sondendesigns (weniger/keine künstlichen Mismatches) sollte durchgeführt werden. Diese Änderu

Ergebnisse 113 Fazit: Nach der Validierung des ESBL-Chips mit klinischen Isolaten wurde die Leistungsfähigkeit der einzelnen Sondensätze analysiert

Ergebnisse 114 Abbildung 3-38: Mischung zweier SHV-Varianten (SHV-1 und SHV-12).(a) Ergebnis der blaSHV-Sequenzierungen der Isolate 2, 24 und 37. An

Ergebnisse 115 3.1.5.7. Kreuzhybridisierungen Abschließend wurden auf der Basis der Validierungs-Experimente, und in Anlehnung an Kapitel 3.1.4.1,

Summary 8 certain CTX-M group by using a multiplex screening PCR. The PCR product sizes for CTX-M1 and CTX-M9 group members were 864 bp and 870 bp re

Ergebnisse 116 Abbildung 3-40: Kreuzhybridisierungen zwischen den verschiedenen Chipmodulen. Fluoresze

Ergebnisse 117 Abbildung 3-41: Einfluss der Kreuzhybridisierungen auf die Leistungsfähigkeit der betroffenen Sondensätze. Vergleich der relativen

Ergebnisse 118 dieser Artefakte auf die Leistungsfähigkeit der Sondensätze CTX-M 73.MM1/2 und CTX-M 114 festgestellt werden. Dies galt sowohl in An-

Ergebnisse 119 3.2. AmpC-Chipmodul Für eine spätere Erweiterung des ESBL-Microarrays wurde in dieser Arbeit ein DNA-Microarray-Prototyp zum Nachwe

Ergebnisse 120 AmpC 26ACC hauptsächlich Probleme mit der Ausbildung von Haarnadel-Strukturen auftraten, waren die Positionen AmpC 180CIT, AmpC 235CIT

Ergebnisse 121 Tabelle 3-9: Polymorphismen, die für das Sondendesign des AmpC-Chipmoduls berücksichtigt wurden. a, b Die Nummerierung bezieht sich

Ergebnisse 122 Tabelle 3-10: Sequenzen aller Oligonukleotidsonden des AmpC-Chipmoduls Sondenname Sondensequenza LängebTMc Haarnadel ΔGd Dimer ΔGd

Ergebnisse 123 Sondenname Sondensequenza LängebTMc Haarnadel ΔGd Dimer ΔGd (5'-3') (°C) (kcal/mol) (kcal/mol)AmpC 339 AER TTTTTTT

Ergebnisse 124 (b) (a) Tabelle 3-11: Primer zur Amplifikation von Genen der C. freundii - Gruppe Primername1 Primersequenz (5'-3') TM [°C

Ergebnisse 125 (a) (b) Nach der unspezifischen Fragmentierung der Ziel-DNA mit DNase wurden die markierten PCR-Produkte mit Hilfe des Microarrays an

Summary 9 Chip results and DNA-sequencing were 100 % concordant. SHV- and CTX-M-ESBLs were detected in the following combinations: CTX-M (39/54), SH

Ergebnisse 126 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120...|...|...|...|...|...|...|...|...|...|...|...|...|...|...|...|...|...|...|.

Ergebnisse 127 Zur Auswertung der Prozesskontrollen, welche als Sonden zur Gruppenidentifizierung fungierten, wurden ebenfalls relative Intensitäten

Ergebnisse 128 Während CMY-2 an diesen Positionen Nukleotide, die für Alanin (171) bzw. Tryptophan (221) codieren besitzt, ist die Kombination aus Mu

Ergebnisse 129 3.2.3 Analyse der Sondensätze Folgende 5 der 13, für ampC-Gene der C. freundii-Gruppe spezifischen Sondensätze, zeigten optimale Ei

Ergebnisse 130 vorausgesetzt, die Perfect Match-Sonde liefert deutlich höhere Signale. Dieser Sondensatz ist in dieser Form nur zu verwenden, wenn ma

Ergebnisse 131 3.3. OXA-Chipmodul Die Arbeiten zur Evaluierung eines OXA Chipmoduls und dessen Testung mit verblindeten klinischen Proben wurden w

Ergebnisse 132 Abbildung 3-51 zeigt das aktuelle Chip-Layout. Es beinhaltet 148 spezifische Sonden zur Identifikation von 44 verschiedenen OXA-Allele

Ergebnisse 133 Abbildung 3-52: (a) PCR Screening mit Primern OXA-69 forw und OXA-69 rev (siehe Tabelle 2-1). (b) Markierungs-PCR posi

Ergebnisse 134 Abbildung 3-55: (a) Layout des OXA-Chips. Der für die Untergruppe 3 der Gruppe V spezif

Ergebnisse 135 Nach der unspezifischen Fragmentierung der Ziel-DNA mit DNase wurden die markierten PCR-Produkte mit Hilfe des Microarrays analysiert

Summary 10 Table 1: Genotyping of clinical isolates Microarray resultb MIC Noa Isolate blaTEM blaSHV blaCTX-M CTX CAZ CTX/CAZ ESBLc24* E. sa

Ergebnisse 136 Abbildung 3-57: Quantitative Auswertung der verschiedenen Gruppen-spezifischen Sonden. Relative Signalintensitäten (RI) na

Ergebnisse 137 (a) Ab15 (b) Ab62 (c) Ab79 (d) A332 (e) Ab64 (a) Ab33 (b) Ab34 Abbildung 3-59: Relative Signalintensitäten (RI) und deren Standar

Ergebnisse 138 Die Ergebnisse der Chip-Analyse stimmten in allen Fällen mit der zuvor durch Sequenzierung bestimmten Identität der Varianten überein

Ergebnisse 139 (Abbildung 3-59 a). Die weiteren blaOXA-Varianten waren zur G-Sonde perfekt komplementär. In diesen Hybridisierungen verfügte OXA 3.1

Diskussion 140 4. Diskussion Die Zunahme nosokomialer und ambulanter Infektionen, die durch Antibiotika-resistente Bakterien verursacht werden, ent

Diskussion 141 2001). Zweitens können ein niedriges Expressionsniveau des Resistenz-vermittelnden Enzyms, der Inoculum-Effekt und/oder die Pharmakok

Diskussion 142 Experiment. Mit Hilfe des hohen Informationsgehalts einer solchen Methode können, abgesehen von einer umfangreichen Resistenztestung,

Diskussion 143 PCR-Methoden wie die Real-time PCR (gekoppelt mit einer Schmelzkurvenanalyse) oder die Ligations-vermittelte PCR (LDR-PCR) haben deut

Diskussion 144 blaZ). Dieser Microarray wurde zwar in einer späteren Arbeit deutlich erweitert und mit einer Multiplex-PCR gekoppelt, so dass insgesa

Diskussion 145 Obwohl die aktuellen Arbeiten von Batchelor bzw. Zhu und Kollegen eine Tendenz zu einem differenzierteren Nachweis der β-Lactam-Resis

Summary 11 With the phenotypic characterization as the gold-standard, the genotypes delivered by the DNA microarray based assay explained the phenot

Diskussion 146 (Jemima und Verghese 2008). Die Größe der Produkte diente der Identifikation des bla-Gentyps, und die jeweiligen Sequenzabschnitte rei

Diskussion 147 4.3.2 Optimierung der Hybridisierungsbedingungen Die Hybridisierungseffizienz perfekt und nicht perfekt komplementäter Sonden wird

Diskussion 148 integrierten ESBL-Chip und damit auf die SHV- und CTX-M-Chipmodule übertragen werden. Eine Erhöhung der Stringenz der Hybridisierung m

Diskussion 149 ΔG-Werte für Haarnadel-Strukturen berechnet. Es wurde daher kein negativer Einfluss auf das Diskriminierungsvermögen dieses Sondensat

Diskussion 150 Zwei weitere SHV-Sondensätze wurden während des Redesigns entwickelt. Erst der Einbau von Fehlpaarungen führte bei drei Sondensätzen z

Diskussion 151 Die in dieser Arbeit durchgeführte Aktualisierung einzelner Chipmodule und die Integration der drei Chipmodule ist ein Beweis, dass d

Diskussion 152 der Sondenlösung in der entsprechenden Kavität. Außerdem können schwankende Eigenschaften des Microarraysubstrats die Interaktion der

Diskussion 153 unterschiedliche Sensitivitäten und Spezifitäten besitzen (siehe 4.1). In zwei Studien von Wiegand bzw. Thomson und Kollegen (Thomson

Diskussion 154 Situation korrelierte (Wong-Beringer et al. 2002). In der Regel versagte die empirische Behandlung der entsprechenden ESBL-produzieren

Diskussion 155 der in Stuttgart und Frankfurt gesammelten Isolate wurde nicht vorgenommen. Nichtsdestotrotz war keiner der nachgewiesenen Genotypen

Summary 12 Figure 2: Performance of (a) the whole chip and (b) the individual chip modules. The Distribution of RIMM values across different RIMM ran

Diskussion 156 die Diskriminierung allelischer Varianten wichtigen relativen Signalintensitäten, können nur schwer mit anderen Microarray-Studien ver

Diskussion 157 heterozygote Genotypen nur mit schwankender Spezifität und Sensitivität nachweisen (Nickerson et al. 1997). Die hier verwendete alle

Diskussion 158 Ausgangs-DNA-Mengen für die eingesetzten PCR-Protokolle, die ca. 1000 Genomäquivalenten (Barl et al. 2008) oder 100 CFUs (Yu et al. 20

Diskussion 159 Klebsiella spp., Salomonella spp.) oder ihr eigenes ampC-Gen nur schwach exprimieren (z. B. E. coli), relevant. Die vermittelte Re

Diskussion 160 stringenteren Bedingungen, ist mit einer Verbesserung der Diskriminierungsvermögen der AmpC-Sondensätze zu rechnen. Auch der Einfluss

Diskussion 161 aktuell untersucht. Die genotypische Analyse klinischer A. baumanii-Isolate bezüglich OXA-β-Lactamasen ist daher eine interessante Op

Diskussion 162 Varianten, kann die Microarray-basierte ESBL-Detektion in gramnegativen Enterobakterien noch umfangreicher gestaltet werden. 4.6. F

Literaturverzeichnis 163 5. Literaturverzeichnis 1. Adler,H., Fenner,L., Walter,P., Hohler,D., Schultheiss,E., Oezcan,S., Frei,R., 2008. Plasmi

Literaturverzeichnis 164 13. Baraniak,A., Sadowy,E., Hryniewicz,W., Gniadkowski,M., 2002. Two different extended-spectrum beta-lactamases (ESBLs)

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Summary 13 Detection of AmpC- and and OXA beta-lactamases To extend the coverage of the ESBL chip for other relevant beta lactamases and therefore

Literaturverzeichnis 166 40. Canton,R., Novais,A., Valverde,A., Machado,E., Peixe,L., Baquero,F., Coque,T.M., 2008b. Prevalence and spread of exte

Literaturverzeichnis 167 53. Cleven,B.E., Palka-Santini,M., Gielen,J., Meembor,S., Kronke,M., Krut,O., 2006. Identification and characterization

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Literaturverzeichnis 175 159. Meric,M., Kasap,M., Gacar,G., Budak,F., Dundar,D., Kolayli,F., Eroglu,C., Vahaboglu,H., 2008. Emergence and spread o

Summary 14 which was due to the low homology of the genes within the same group. Nevertheless all probe sets could be analyzed due to a clean backgro

Literaturverzeichnis 176 172. Naas,T., Poirel,L., Nordmann,P., 2008. Minor extended-spectrum beta-lactamases. Clin. Microbiol. Infect. 14 Suppl 1,

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Literaturverzeichnis 183 263. Volokhov,D., Rasooly,A., Chumakov,K., Chizhikov,V., 2002. Identification of Listeria species by microarray-based ass

Literaturverzeichnis 184 prevalent OXA carbapenemases in Acinetobacter spp. Int. J. Antimicrob. Agents 27, 351-353. 278. Woodford,N., Fagan,E.J.,

Anhang 185 6. Anhang 6.1. Abkürzungsverzeichnis Die Bezeichnung von Aminosäuren und Nukleotiden erfolgte mit Hilfe von Ein- oder Dreibuchstabenco

Summary 15 Conclusion and outlook The developed integrated oligonucleotide microarray for the genotyping of TEM, SHV, and CTX-M beta-lactamases has

Anhang 186 MM Mismatch MOS Moskau, Russland MOX Name einer β-Lactamase, aktiv gegen Moxalactam mRI mittlere relative Signalintensität MUT Mutante M

Anhang 187 6.2. Sondensequenzen Die folgenden Tabellen fassen die Bezeichnungen, Sequenzen, Längen und Schmelztemperaturen aller Sondensätze, die i

Anhang 188 Sondennamea Sondensequenz (5'-3')b Längec TMd TEM 238.2 TTTTTTTTTTTTTCTGGAGCCGNTGAGCGTG 18 61.5 TEM 240 TTTTTTTTTTTTTGAGCCGGT

Anhang 189 Sondennamea Sondensequenz (5'-3')b Längec TMd SHV 175WT TTTTTTTTTTTTTGCTTCCCGGCGACTCC 16 54.0 SHV 175MUT TTTTTTTTTTTTTGCTTCC

Anhang 190 Sondennamea Sondensequenz (5'-3')b Längec TMd CTX-M 61.1 TTTTTTTTTTTTTAATTCTCTACNGTACCGATGA 21 - CTX-M 61.2 TTTTTTTTTTTTTAATT

Anhang 191 Sondennamea Sondensequenz (5'-3')b Längec TMd ACC-spezifische Sonden AmpC 26 ACC TTTTTTTTTTTTTCAAGGTGCTNTGGCTGC 17 56.9 AmpC

Anhang 192 Sondennamea Sondensequenz (5'-3')b Längec TMd OXA Gr. II - B TTTTTTTTTTTTTAAACAGGCTGGGATGGT 17 54.0 OXA Gr. II - C TTTTTTTTTT

Anhang 193 6.3. Chip-Layouts Die folgenden 2 x 2-Subarray-Layouts wurden zum Teil während der Integration der Chipmodule und der Optimierung der Hy

Anhang 194 Abbildung 6-2: Original CTX-M-Chipmodul. Die theoretischen Perfect Matches bei einer Hybridisierung mit CTX-M-1,

Anhang 195 6.4. Empfindlichkeitstestungen der klinischen Isolate (I) Minimale Hemmkonzentrationen (MHK) wurden mit Hilfe der VITEK 2-Testkarte zur

Einleitung 16 1. Einleitung 1.1. β-Lactam-Resistenz – Hintergrund Die Entdeckung des Penicillins durch den englischen Bakteriologen Alexander Fle

Anhang 196 Nummera Isolat ESBLb PIP AMX/MEZ SAM/AMC TZP CFZ CXM CXM (axetil) CPD CTX/CRO CAZ IMP MER TET/DOX GEN TOB/AMK SXT CIP LEV NIT ≥128 ≥32

Anhang 197 (II) Empfindlichkeitstestungen gemäß CLSI-Richtlinien am Institut für medizinische Mikrobiologie und Hygiene, J.W. Goethe-Universität, Fr

Anhang 198 (III) Empfindlichkeitstestungen gemäß CLSI-Richtlinien in der Abteilung für Labormedizin, Robert Bosch Krankenhaus, Stuttgart, Deutschland

Anhang 199 6.5. Sequenzen der detektierten bla-Gene GenBank Accession-Nr. Nr.a Isolat blaTEM blaSHV blaCTX-M 24* E. sakazakii FJ668730 FJ6688

Anhang 200 6.6. Veröffentlichungen aus dieser Arbeit 6.6.1 Publikationen Dirk M. Leinberger, Verena Grimm, Maya Rubtsova, Jan Weile, Klaus Schröp

Anhang 201 6.7. Danksagung Zuallererst möchte ich mich bei Prof. Dr. Rolf D. Schmid für das Vertrauen beim Überlassen des sehr interessanten Themas

Anhang 202 und Unterstützung bei meinem Aufenthalt in München und den wissenschaftlichen Austausch in den Bereichen ARB und Speziesidentifikation bed

Anhang 203 6.8. Lebenslauf Persönliche Daten Name: Leinberger Vorname: Dirk Michael Geburtsdatum: 16. April 1977 Geburtsort: Tettnang Nati

Einleitung 17 die freigewordene Carboxylgruppe mit einer freien Aminogruppe eines zweiten Oligopeptids. Das endständige D-Alanin wird dabei freigese

Einleitung 18 des Antibiotikums aus der Zelle ist das MexAB-OprM-System bei P. aeruginosa (Poole 2005). Tabelle 1-1: Einteilung der β-Lactam Antibio

Einleitung 19 Der wichtigste Resistenzmechanismus gramnegativer Bakterien gegenüber β-Lactam-Antibiotika ist die Produktion von Enzymen, die den β-L

Einleitung 20 Cefepim, Cefipirom (Cephalosporine der 4. Generation) und Carbapenemen vermitteln, und zudem unempfindlich gegenüber β-Lactamase-Inhibi

Einleitung 21 ermöglichen (Giske et al. 2009). Dafür wurden die Begriffe ESBLA für Klasse A β-Lactamasen, ESBLM für verschiedene Klasse C und D β-La

Einleitung 22 Wirkspektrum und β-Lactamase-Inhibitoren. Eine vollständige Kombination beider Aktivitäten scheint jedoch nicht möglich, so dass sich v

Einleitung 23 werden. Beispiele sind β-Lactamasen der SFO-, BES-, BEL-, TLA-, GES-, PER- und VEB-Familien. Bei Enzymen der PER-, VEM- und GES-Famili

Einleitung 24 Rumänien: 28 % und Türkei: 40 %). Empfindlichkeitsdaten für K. pneumoniae-Isolate wurden erst ab 2005 umfassend gesammelt. Die Resisten

Einleitung 25 K. pneumoniae). Im Vergleich zu 2004 stieg der Anteil an E. coli-Isolaten mit einem ESBL-Phänotyp von 5,1 auf 10,3 %, der Anteil an K.

Erklärung Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig und nur unter Zuhilfenahme de

Einleitung 26 führen, oder (III) Mutationen, die die Attenuation des ampC-Gens beeinflussen. Mutationen im Promotorbereich spielen hierbei die größte

Einleitung 27 sich nach ihrer Mobilisation deutlich verändert. Dabei kam es jedoch im Gegensatz zur Evolution der TEM- oder SHV-β-Lactamasen zu kein

Einleitung 28 1.4.1 OXA-Enzyme mir erweitertem Substratspektrum Obwohl sich die Definition für ESBLs, also eine Erweiterung des Resistenz-Spektrum

Einleitung 29 2005; Evans et al. 2007; Evans et al. 2008; Tsakris et al. 2007). Diese unterscheiden sich in bis zu sechs Aminosäuren. Die Gene sind

Einleitung 30 Die verschiedenen Aspekte können unterschiedlich gewertet werden und es verwundert daher nicht, dass verschiedene Organisationen, die s

Einleitung 31 Ein Standard-Test für die ESBL-Produktion in Enterobakterien ist der Double Disk Synergy Test (DDST) (Jarlier et al. 1988). Zwei Filte

Einleitung 32 Die beschriebenen Methoden sind günstig. Die Notwendigkeit von zusätzlichen Bestätigungstestes und die zahlreichen Faktoren, die diese

Einleitung 33 Genvarianten zu identifizieren und in der Routine eingesetzt werden, können sie zusätzlich wichtige epidemiologische Daten liefern. So

Einleitung 34 Zip-Code-Sonden (Gerry et al. 1999). Ebenso vielfältig wie die Assays zur Genotypisierung sind die Methoden zur Detektion der entstande

Einleitung 35 Gensequenzen von 21 verschiedenen blaSHV-Referenzgenen konnten korrekt identifiziert werden. Fast alle dieser Techniken besitzen nur

Einleitung 36 Für diagnostische Microarrays wurden verschiedenen Plattformen verwendet. Im Gegensatz zur photolithografischen Synthese von Sonden auf

Einleitung 37 2005; Frye et al. 2006; Perreten et al. 2005), grampositive Bakterien (Perreten et al. 2005) oder Sepsis (Cleven et al. 2006) entwicke

Einleitung 38 des Ziel-Moleküls, Ampflifikation, Detektion und Auslesen der Signale) in einem einzigen System integrieren und damit unabhängig vom Be

Material und Methoden 39 2. Material und Methoden 2.1. Materialien 2.1.1 Geräte Geräte Typenbezeichnung Hersteller DNA-Sequenziergerät AB

Material und Methoden 40 2.1.3 Bioreagenzien und Kits Bioreagenzien und Kits Hersteller Big-dye Terminator Cycle Sequencing Kit Applied Biosystem

Material und Methoden 41 Name Zusammensetzung 20x SSC 3 M NaCl 300 mM Na3Citrat·2 H2O pH 7,0 50x TAE-Puffer 2M Tris-Acetat-Puffer 50mM EDTA

Material und Methoden 42 Spezies Bezeichnung/Beschreibung Herkunft Genotyp Escherichia coli DH5α, blaSHV auf Plasmid pCCR9 ZÜR SHV-2 Escherichi

Material und Methoden 43 Nummer Spezies klinische Probe Bezeichnung Herkunft ESBL-Phänotyp17 Klebsiella terrigena Urin VA04602 FRA + 18 Escheric

Material und Methoden 44 2.2. Methoden 2.2.1 Sequenzanalyse Mit Hilfe von multiplen Sequenzalignments verfügbarer Nukleotidsequenzen verschiedene

Material und Methoden 45 2.2.2.2. Alternatives Sondendesign (I) Der Sondensatz für die Positionen 238 und 240 der SHV-Aminosäuresequenz deckt die E

Inhaltsverzeichnis 1 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis ...

Material und Methoden 46 5’-TTTTTTTTTTTTTAGAAACGCTGGTGAAAGT-3’; SHV: 5’-TTTTTTTTTTTTTTTT AAAGTAGTGCTCTGCGGC-3’; CTX-M: 5’-TTTTTTTTTTTTTTATCGCGGT GATC

Material und Methoden 47 Der Wechsel von nicht-modifizierten zu aminomodifizierten TEM-Sonden wurde zum selben Zeitpunkt wie der Wechsel zu Nexterio

Material und Methoden 48 Testkarte zur Empfindlichkeitsprüfung gramnegativer Keime (AST-N062) und einem VITEK 2XL System (bioMérieux, Marcy l'Et

Material und Methoden 49 nachgewiesenen Gene anschließend separat mit den zur jeweiligen CTX-M-Gruppe zugehörigen Primern (Eckert et al. 2006) ampli

Material und Methoden 50 Zielgen Primername1 Primersequenz (5'-3') Referenz blaCTX-M-1-ähnlich CTX-M1-rev TTGGTGACGATTTTAGCCGC diese Arb

Material und Methoden 51 Technologies, Rockland, Maine) bestimmt. Für eine Messung wurden 1,5 µl des aufgereinigten PCR-Produkts benötigt. Gegebenen

Material und Methoden 52 entstandene Reaktionsraum mit einem entsprechenden Cover Slip verschlossen. Die Hybridisierung erfolgte in einem speziellen

Material und Methoden 53 (a) (b) Es wurde daher eine Normalisierung durchgeführt, wobei die Nettosignalintensitäten (NI) jedes Spots einer bestimmen

Material und Methoden 54 Bei der Analyse der Signalcharakteristik der relevanten Sonden bei Mischungen wurden zusätzlich zu den Standardabweichungen

Material und Methoden 55 Zielgen Primername1 Primersequenz (5'-3') Referenz blaCTX-M-9-ähnlich CTX-M9-rev siehe Tabelle 2.1 CTX-M9seq

Inhaltsverzeichnis 2 2.2.4 Stämme, Isolate und Empfindlichkeitstestungen ...47 2.2.4.1. Referenzstämme...

Ergebnisse 56 3. Ergebnisse 3.1. ESBL-Microarray – TEM-, SHV- und CTX-M-β-Lactamasen Für die Entwicklung eines integrierten ESBL-Microarrays zur

Ergebnisse 57 3.1.1 PCR-Etablierung Die Ziel-DNA für die Hybridisierung wurde mittels PCR hergestellt. Für einen Assay zur gleichzeitigen Genotypis

Ergebnisse 58 (I) 5 bei 58 °C und 25 bei 54 °C, (II) 10 bei 58 °C und 20 bei 54 °C und (III) jeweils 15 bei 58 °C und 54 °C. Tabelle 3-1: „origina

Ergebnisse 59 besten Kompromiss. Dieses PCR-Protokoll wurde als Markierungs-PCR zur gleichzeitigen Vervielfältigung derselben blaTEM-, blaSHV- und

Ergebnisse 60 Fazit: Die Amplifikation von blaTEM, blaSHV und blaCTX-M in einem Multiplex-PCR-Format konnte gezeigt und hergestellte markierte Ziel

Ergebnisse 61 Die durchschnittliche TM von 52, °C lag nur 0,1 °C über der durchschnittlichen TM der CTX-M-Primer. Die TEM- und SHV-Primer sind in Ta

Ergebnisse 62 Fazit: Die modifizierten CTX-M-Primer konnten einzeln für die Amplifizierung von blaCTX-M-Genen verschiedener CTX-M-Gruppen mit einer

Ergebnisse 63 Abbildung 3-5: Etablierung der Multiplex-PCR zur Detektion von blaCTX-M-Genen I. Vergleich verschiedener Annealing-Temperaturen (5

Ergebnisse 64 Zu (III): Zur Herstellung der markierten blaCTX-M-Ziel-DNA für die Hybridisierung wurden Gruppen-spezifische Primer verwendet. Diese vo

Ergebnisse 65 3.1.2 Optimierung der Hybridisierungsbedingungen Die Sonden der verschiedenen Chipmodule zur Genotypisierung von blaTEM, blaSHV und

Inhaltsverzeichnis 3 4.3.6 Validierung mit klinischen Isolaten...152 4.3.7 Leistungsm

Ergebnisse 66 verwendet. Alternativ wurde eine SDS-haltige 2x SSPE-Lösung getestet. Die SDS-Konzentration betrug 0,001 %. Parallel wurden folgende Hy

Ergebnisse 67 (IV) Die verschiedenen PMT-Einstellungen hatten natürlich einen direkten Einfluss auf die absoluten Signalintensitäten. Es konnte auch

Ergebnisse 68 In einer zweiten Versuchsreihe wurde überprüft, inwiefern sich die Ergebnisse der ersten Versuchsreihe auf die automatisierte Hybridisi

Ergebnisse 69 Abbildung 3-11: Einfluss der Hybridisierungstemperatur auf die Verteilung der relativen Intensitäten aller Mismatch-Son

Ergebnisse 70 Bei SDS-Konzentrationen von 0,01 % und größer wurden weder Rückstände im Hintergrund noch andere Artefakte detektiert. (II) Der Einsat

Ergebnisse 71 Versuchen eingesetzten Slides um Objektträger mit kleinerem Kontaktwinkel, also einer hydrophileren Oberfläche. Die im Vergleich hydro

Ergebnisse 72 wird eine Temperatur von 120 °C verwendet. Zur Klärung, welche der Temperaturen zur Immobilisierung beider Sondenvarianten verwendet we

Ergebnisse 73 Intensitätseinheiten, der IPM-Wert der SHV-Sonden ca. 16000. Theoretisch könnten die verschiedenen Chipmodule oder sogar einzelne Sond

Ergebnisse 74 Ziel-DNA-Mischung berechnet wurde, waren die Einbauraten der einzelnen Ziel-DNA-Typen nicht bekannt. Trotz dieser Variationen bezüglich

Ergebnisse 75 Abbildung 3-16: (a) Umgestaltetes Layout des Dreifach-Chips zur Genotypisierung von TEM-, SHV- und CT

Zusammenfassung 4 Zusammenfassung Eine der größten Resistenzproblematiken in der Humanmedizin ist die Unempfindlichkeit gramnegativer Infektionserr

Ergebnisse 76 Abbildung 3-17: Integration dreier Chipmodule. (a) Ergebnis der getrennten Amplifikation von TEM/SHV- und CTX-M-β-Lactamasegenen. Te

Ergebnisse 77 Zur Abschätzung der Qualität der Microarray-Herstellung vor und nach der Umstellung des Herstellungsprozesses wurde die Morphologie ei

Ergebnisse 78 wurden insgesamt 22 der 23 Polymorphismen berücksichtigt. Wie bereits zuvor (Grimm 2005) wurde die Deletion der Aminosäure 54 bei SHV-9

Ergebnisse 79 Insgesamt wurden für die Genotypisierung der 22 Positionen 41 Sondensätze entworfen (siehe Tabelle 3-4). Die berechneten Schmelztemper

Ergebnisse 80 Sondennamea Sondensequenzb LängecTMdHaarnadel ΔGe Dimer ΔGe (5'-3') (°C) (kcal/mol) (kcal/mol) AAAAGCTTCTTACGGATGGC

Ergebnisse 81 Sondennamea Sondensequenzb LängecTMdHaarnadel ΔGe Dimer ΔGe (5'-3') (°C) (kcal/mol) (kcal/mol) SHV 61.cWT CGCC

Ergebnisse 82 Die genauen Auswirkungen künstlicher Fehlpaarungen sind in silico schwierig abzuschätzen. Um bei Testhybridisierungen verschiedene Sond

Ergebnisse 83 Abbildung 3-19 zeigt das integrierte Testchip-Layout zur Aktualisierung der TEM- und SHV-Chipmodule. Das Layout enthält sowohl die ver

Ergebnisse 84 Abbildung 3-21: Signalintensitäten (I) der TEM- bzw. SHV-spezifischen Sondensätze des Testchips (a, b bzw. c, d) nach gleichzeitiger

Ergebnisse 85 Abbildung 3-22: Relative Signalintensitäten (RI) der TEM- bzw. SHV-spezifischen Sondensätze des Testchips (a, b bzw. c, d) nach glei

Summary 5 Summary Background One of the major threats in human healthcare is the resistance of widespread pathogens, such as E. coli, Klebsiella

Ergebnisse 86 Abbildung 3-23: (a) Signalintensitäten (I) und (b) relative Signalintensitäten (RI) des Sondensatzes TEM 173 nach Hybridisieru

Ergebnisse 87 ungünstigen Sekundärstruktur (siehe ΔGDimer-Werte) und damit die oben beschriebene Anwendung. Die Entwicklung des Sondensatzes TEM 224

Ergebnisse 88 (2) Der Sondensatz TEM 157.a wurde für das TEM-Chipmodul ausgewählt, da es sich im Gegensatz zu TEM 157.b um einen mit vier Sonden voll

Ergebnisse 89 (10) Der Sondensatz 269.a zeigte eine bessere Diskriminierung als der Sondensatz 269.b. Auch bei diesem Sondensatz hatten die berechne

Ergebnisse 90 diesem Sondensatz aber bereits der Sondensatz SHV 61.b vorgezogen. Die weitaus stärkeren Kreuzhybridisierungen (4000 bzw. 7800 Intensit

Ergebnisse 91 Fazit: Für die Genotypisierung von 22 Mutationen in blaTEM und blaSHV wurden 41 Sondensätze entworfen und getestet. Von diesen wurden

Ergebnisse 92 Für die Sondensätze TEM 184 und TEM 237.2 wurde ein Redesign durchgeführt, mit dem Ziel einer besseren Diskriminierung. Die vorhandenen

Ergebnisse 93 Die absoluten Signalintensitäten der jeweiligen Perfect Match-Sonden lagen alle über 2400 IE. Damit wurde keiner der hier betrachteten

Ergebnisse 94 und verbesserte das Diskriminierungsvermögen des Sondensatzes, verringerte aber die Signalintensitäten der SE- und SK-Sonden drastisch

Ergebnisse 95 Tabelle 3-6 fasst die Originalsonden (ohne Erweiterung des Sondennamens) und verschiedene neu entwickelte Varianten der einzelnen Sond